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Säulenchromatographie

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Dort Chromatographie (aus dem Griechischen χρῶμα, transliteriert in khrôma ist „Farbe“ eine Technik zum Trennen der Komponenten eines homogenen Gemisches auf der Grundlage der Verteilung seiner Komponenten auf zwei Phasen, von denen eine stationär ist und eine sich entlang einer definierten Richtung bewegt. ImSäulenchromatographieDie Richtung geht von oben nach unten und wird durch eine Glasröhre (die Säule) vorgegeben.

Dort Säulenchromatographie ist eine spezielle chromatographische Technik, die auf der Eigenschaft basiert, dass einige Substanzen, sobald sie in geeigneten Lösungen gelöst sind, mit einer geeignet hergestellten festen Matrix interagieren. Ich werde versuchen, besser zu erklären, was es bedeutet, was ich gerade geschrieben habe!

Säulenchromatographie: was es ist

Es ist nichts weiter als eine chromatographische Trennmethode, die in einer Glassäule stattfindet. Diese Technik nutzt den Unterschied in Ladung, Größe, Bindungsaffinität oder anderen Eigenschaften der zu isolierenden Komponente aus, um Banden mit unterschiedlichen Eigenschaften zu erzeugen.

Auf den Fotos auf dieser Seite zeigen wir Ihnen die Sequenzen derSäulenchromatographieund insbesondere die Extraktion des Eluats, dh der "teilweise gereinigten" Substanz, die aus dem Endauslauf der Glassäule austritt.

DortSäulenchromatographieEs ist sehr nützlich für die Reinigung von Proteinen und für die Trennung einer großen Anzahl von Substanzen, die einzeln untersucht werden sollen. Manchmal werden Substanzen mit isoliertSäulenchromatographie Sie verlieren die Eigenschaften, die sie in der Mischung hatten. Es hängt alles von der Technik abSäulenchromatographieund von der Substanz, die Sie reinigen möchten.

Säulenchromatographie: wie es funktioniert

Eine Glasröhre ist mit einem porösen festen Material gefüllt, definiert als "stationäre Phase". Die stationäre Phase hat geeignete chemische Eigenschaften, die auf der Grundlage der zu reinigenden / vom Gemisch zu trennenden Substanz ausgewählt werden. Die Säule wird dann mit einer Pufferlösung gefüllt, die ebenfalls geeignet formuliert ist. Die Pufferlösung heißt "Mobile PhaseUnd enthält die Mischung, die Sie trennen möchten.

Die zu trennende Mischung wird in gelöstMobile Phase. Die mobile Phase kommt danngeschichtetauf der Oberseite desSäuleund versickerte durch diestationäre Phase(die feste Matrix). Auf diese Weise diffundiert die Lösung entlang derSäuleund bildet ein kontinuierliches Band entlang der gesamten stationären Phase. Die Substanzen, die die Säule eluieren (verlassen), haben spezifische Eigenschaften, die auf der Reihenfolge der Vermeidung basieren.

Nehmen wir zum besseren Verständnis das Beispiel der Proteinreinigung, obwohl die mobile Phase durch jede Mischung dargestellt werden kann. Wir werden die einzelnen Proteine ​​aus dem eluieren lassen Säule mehr oder weniger schnell entsprechend ihren Eigenschaften.

Je nach Art der stationären Phase haben wir verschiedene Techniken vonSäulenchromatographie, Welche:

  • Ionenaustauschchromatographie
  • Molekulare Ausschlusschromatographie
  • Affinitätschromatographie

Es gibt auch eine teurere Technik, die hohen Druck verwendet, nämlich dieHochdruckflüssigkeitschromatographieoder HPLC.

Ionenaustauschchromatographie

Im IonenaustauschchromatographieDie feste Matrix (stationäre Phase) ist reich an positiven oder negativen Ladungen. Es versteht sich von selbst, dass dieIonenaustauschchromatographienutzt die Unterschiede in Art und Intensität vonelektrische Nettoladungbei einem bestimmten pH.

In diesem Fall ist diestationäre Phaseist ein synthetisches Polymer (Harz), das negativ geladene Gruppen enthält (daher sprechen wir vonKationenaustauscher) oder positiv geladene Gruppen (wir sprechen vonAnionenkrätze).

Zurück zum Beispiel der Proteinreinigung: Der Ladungsunterschied hängt mit der Anwesenheit von Aminosäuren mit bestimmten funktionellen Gruppen zusammen. Die Affinität jedes Proteins für die geladenen Gruppen vonSäulees hängt vom pH-Wert ab, der wiederum den Ionisationszustand der funktionellen Gruppen der Aminosäurebestandteile beeinflusst.

ImSäulenchromatographieDie Lösung für die mobile Phase ist entscheidend. In unserem Beispiel mit Proteinen können die Salzkonzentration und der pH-Wert einen Gradienten erzeugen, der die Extrusion bestimmter Proteine ​​begünstigen kann.

Ionenchromatographie: Kationenaustausch

Im Falle der IonenchromatographieBei der Kationenaustauschmatrix weist die feste Matrix negativ geladene Gruppen auf, sodass Proteine ​​mit positiver Nettoladung als letzte aus der Säule fließen. Die ersten Verbindungen, die aus demSäuleEs handelt sich um solche mit einer starken negativen Nettoladung (durch Abstoßung von der Matrix), dann treten Substanzen mit einer teilweise negativen Ladung aus. Die zu eluierenden Substanzen bewegen sich durch dieSäulemit einer Rate, die von ihrer Nettoladung in der verwendeten Lösung abhängt.

Molekulare Ausschlusschromatographie

In diesem Fall wird das Gemisch (mobile Phase) in einem zugegebenSäulemit aPolymermit Vernetzungen und Molekülen ausisolierenSie werden nach Größe getrennt. Instinktiv denkt man, dass die kleinsten Moleküle zuerst aus der Säule kommen, aber in Wirklichkeit ist es genau das Gegenteil.

Die größeren Moleküle werden gezwungen sein, den kürzesten Weg bis zum Ende der Säule zurückzulegen. Durch Diffusion können die kleineren Moleküle die Poren der festen Matrix durchdringen, wobei die Elution länger dauert. Das erste gesammelte Eluat ist dasjenige, das die größten Moleküle enthält.

Affinitätssäulenchromatographie

In der stationären Phase liegt ein Ligand vor. Während die zu trennende Lösung die Säule passiert, bilden Moleküle, die eine Affinität zu diesem Liganden haben, eine spezifische Bindung. Die interessierenden Substanzen werden in der ersten oder letzten Fraktion aufbewahrt, die je nach Art des verwendeten Liganden gesammelt wird.

Hochdruckflüssigkeitschromatographie

Die Techniken vonSäulenchromatographiesoeben beschrieben kann eine diskrete Auflösung der Bänder haben. Der Grund? Jede Substanz neigt dazu, nach einer bestimmten Zeit zu diffundieren.

Durch die Verwendung von Hochdruckpumpen nimmt die Geschwindigkeit zu und die Zeit, die die Moleküle benötigen, um die Säule zu bewegen, nimmt ab. In diesem Zusammenhang sind chromatographische Matrizen erforderlich, die starken Drücken standhalten können.

Durch die Reduzierung der Transitzeit durch die Spalte wird dieHochdruckflüssigkeitschromatographie(HPLC) begrenzt die Ausbreitung der Banden und verbessert die Auflösung des gesammelten Eluats erheblich.


Video: Pflanzenphysiologie - Chromatographie von Blattfarbstoffen (Kann 2022).


Bemerkungen:

  1. Jozef

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